复合骨髓间充质干细胞同种异体支架骨修复羊髂骨极限缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (16): 2859-2868.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.002

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复合骨髓间充质干细胞同种异体支架骨修复羊髂骨极限缺损

杨楠，何惠宇，胡杨，杨川博

新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2013-01-14 修回日期:2013-01-22 出版日期:2013-04-16 发布日期:2013-04-16
通讯作者: 何惠宇，硕士生导师，教授，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 hehuiyu02@sina.com
作者简介:杨楠★，女，1985年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学的基础研究。yangnan8513@sina.com
基金资助:
国家自然科学基金地区基金项目(81060088)《三维打印构建组织工程化牙槽骨的实验研究》；新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2011211A073)《荧光蛋白标记的组织工程骨修复颌骨缺损及其成骨能力的观测研究》。

Bone marrow mesenchymal stem cells seeded into an allogeneic scaffold repair critical-sized iliac defects in sheep

Yang Nan, He Hui-yu, Hu Yang, Yang Chuan-bo

Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2013-01-14 Revised:2013-01-22 Online:2013-04-16 Published:2013-04-16
Contact: He Hui-yu, Master’s supervisor, Professor, Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China hehuiyu02@sina.com
About author:Yang Nan★, Studying for master’s degree, Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China yangnan8513@sina.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81060088*; Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A073*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前国内外有关组织工程骨材料及构建方法的研究持续升温，而临床上如何修复大面积骨缺损仍然是研究的难点和重点。
目的：对比观察同种异体骨支架材料、β-磷酸三钙材料以及碱性成纤维细胞生长因子慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞的组织工程骨对羊髂骨极限骨缺损的修复效果。
方法：体外诱导培养羊骨髓间充质干细胞至第3代时，构建碱性成纤维细胞生长因子慢病毒载体。将转染及未转染的骨髓间充质干细胞同种异体支架骨材料、单纯同种异体骨支架材料、β-磷酸三钙材料回植入羊髂骨极限缺损模型(15 mm×10 mm×10 mm)，修复后4，8，12周末进行影像学、组织学及扫描电镜观察。
结果与结论：碱性成纤维细胞生长因子慢病毒转染羊骨髓间充质干细胞后的组织工程骨材料修复极限骨缺损优于未转染的细胞骨支架材料、单纯同种异体骨支架材料及β-磷酸三钙材料；未转染的细胞骨支架材料优于单纯同种异体骨支架材料与β-磷酸三钙材料组；单纯同种异体骨支架材料降解速率大于β-磷酸三钙材料。结果提示，以碱性成纤维细胞生长因子慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞加载同种异体骨支架材料构建的组织工程骨符合骨修复的需求，既可以引导新骨形成，又不会妨碍骨组织的重建和塑型，具有良好的生物相容性。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 极限骨缺损, 碱性成纤维细胞生长因子, 慢病毒载体, 骨髓间充质干细胞, 组织工程骨, 骨支架材料, β-磷酸三钙材料, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays, the research regarding tissue engineering bone materials and construction methods continues to heat up, and how to repair large bone defects is still difficult in the clinic.
OBJECTIVE: To compare the effects of tissue engineering bones with allogeneic scaffold material, β-tricalcium phosphate material and basic fibroblast growth factor lentiviral vector-transfected bone marrow mesenchymal stem cells on the repairing of critical-sized iliac defects in sheep.
METHODS: The sheep bone marrow mesenchymal stem cells were in vitro induced and cultured to the third generation, and then the basic fibroblast growth factor lentiviral vector was constructed. The allogeneic scaffold materials with transfected and untransfected bone marrow mesenchymal stem cells, simple allogeneic scaffold materials and β-tricalcium phosphate materials were implanted into the sheep model of critical-sized iliac defects (15 mm×10 mm×10 mm). Imaging, histology, and scanning electron microscopy observations were performed at 4, 8 and 12 weeks after repairing.
RESULTS AND CONCLUSION: The repairing effect of allogeneic scaffold materials with basic fibroblast growth factor lentiviral vector transfected bone marrow mesenchymal stem cells on sheep critical-sized iliac defects was better than that of untransfected allogeneic scaffold materials, simple allogeneic scaffold materials and β-tricalcium phosphate materials; the effect of untransfected allogeneic scaffold materials was better than that of simple allogeneic scaffold materials and β-tricalcium phosphate materials; the degradation rate of simple allogeneic scaffold materials was higher than that of β-tricalcium phosphate materials. The tissue engineering bone constructed using allogeneic scaffold materials with basic fibroblast growth factor lentiviral vector-transfected bone marrow mesenchymal stem cells can meet the requirement of bone repairing, and it can guide the new bone formation with good biocompatibility and cannot interfere with bone tissue reconstruction and modeling.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, critical-sized defect, basic fibroblast growth factor, lentiviral vector, bone marrow mesenchymal stem cells, tissue engineering bone, bone scaffold materials, β-tricalcium phosphate materials, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

杨楠，何惠宇，胡杨，杨川博. 复合骨髓间充质干细胞同种异体支架骨修复羊髂骨极限缺损[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(16): 2859-2868.

Yang Nan, He Hui-yu, Hu Yang, Yang Chuan-bo. Bone marrow mesenchymal stem cells seeded into an allogeneic scaffold repair critical-sized iliac defects in sheep[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(16): 2859-2868.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析 羊双侧髂骨各制造2处缺损，将4组材料同时植入，9只羊于实验4，8，12周末每次处死3只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 大体观察结果 术后4，8，12周观察动物，无一跛行，感染或死亡。

4，8，12周末随机处死3只动物，将植骨区扩大5 mm电钻锯断取出，去尽软组织，观察标本发现12周末骨支架组材料完全被骨膜覆盖，术区充满结缔组织生长，植骨区硬度明显下降；β-磷酸三钙材料完全被骨膜覆盖，术区不平整，缺损凸起表面修复，硬度变化小；骨髓间充质干细胞复合骨支架组标本完全被骨膜覆盖，表面充满结缔组织，植骨区特别是中央部位硬度也有明显下降；碱性成纤维细胞生长因子转染组术区完全被骨膜覆盖，术区充满结缔组织，缺损修复区硬度与周围基本一致，骨皮质表面平整无凹陷或凸起。

2.3 扫描电镜结果 4，8，12周末处死动物，将植骨区扩大5 mm电钻锯断取出，去尽软组织，扫描各组不同材料植骨区。发现骨支架组结合区有纤维化，基本无细胞爬入支架骨小梁内，类似死骨结构。β-磷酸三钙材料组无明显支架结构存在，在结合区有大量纤维化，中央区无细胞及纤维结缔组织爬入。骨髓间充质干细胞复合骨支架组骨小梁结构内有少量细胞爬入，但中央区仍为死骨结构。碱性成纤维细胞生长因子转染组植骨区有大量细胞，细胞形态饱满，细胞伸出伪足，还可见纤维结缔组织覆盖骨支架空隙，见图5-8。

2.4 苏木精-伊红染色结果 12周末处死动物，将植骨区扩大5 mm电钻锯出，去尽软组织，将标本置于体积分数4%甲醛溶液中(pH=7.4，4 ℃)固定24 h，2%EDTA脱钙2-4周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片，切片厚度5 μm，进行苏木精-伊红染色，光镜下观察。

4周末，骨支架组、β-磷酸三钙材料组主要为死骨结构，术区材料周围有成纤维细胞包绕；未转染细胞组结合区可见成软骨样结构，中央区为死骨结构，见图9-12。

8周末，骨支架组、β-磷酸三钙材料组主要为死骨结构，术区结合部位有成软骨化表现；未转染细胞组在手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，中央区为死骨结构；而碱性成纤维细胞生长因子转染组可见手术结合区及支架空隙周围有成软骨样结构及成骨样细胞出现，内有成骨样细胞排列。

12周末，骨支架组、β-磷酸三钙材料组术区可见成纤维细胞，结合区为成软骨化表现；未转染细胞组结合区有成软骨样结构及骨小梁出现，中央区少量成纤维细胞；而碱性成纤维细胞生长因子转染组可见手术结合区及支架空隙周围有大量成软骨样结构及成骨样细胞出现，结合区可见骨小梁结构。

2.5 X射线片观察结果在4，8，12周末处死动物前，将动物人工固定，进行数字化DR片检查，采用荷兰 PhilipsDigital diagnost 床式数字图像增强器，配备电脑DAP显示，采用自动曝光控制中心电离室技术，400速自动曝光。

操作参考文献[22]进行。动物摄片体位为骨盆正位。采用西门子PACS影像信息管理系统，分辨率为4 096× 2 560，见图13-18。由X射线摄片检查结果显示：
4周时，转染组术区影密度最高，骨皮质基本有增生影，术区骨密度均匀，并高于其他3组；未转染细胞组相比单纯骨支架组、β-磷酸三钙材料组术区密度较均匀；单纯骨支架材料组、β-磷酸三钙材料组可见明显的材料植入区与周边缺损影形成灰度差，说明材料仍未降解及吸收。
8周时，术区影密度：转染组>未转染细胞组>骨支架组>β-磷酸三钙材料组，转染组术区骨皮质已基本连续；而骨支架材料组与β-磷酸三钙材料组术区骨皮质仍有不平，单纯骨支架材料组、β-磷酸三钙材料组可见明显的材料植入区与周边缺损影仍有灰度差，说明材料开始降解但还未充分吸收。
12周时，术区影密度：转染组>未转染细胞组>骨支架组>β-磷酸三钙材料组；转染组骨皮质连续，均匀；而细胞组密度影像基本均匀，骨皮质连续；骨支架材料组、β-磷酸三钙材料组出现明显术区骨密度影减低，证明在12周末，转染组良好地修复了缺损区，而骨支架材料组材料出现了明显降解和吸收，大于β-磷酸三钙材料组的降解和吸收。

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引言

大面积骨缺损在临床上较为复杂，骨再生量要求大，如由外伤，感染产生的大段骨缺损的骨重建，肿瘤切除及骨骼畸形，或在何种情况下，再生过程中被破坏，包括股骨头缺血性坏死，萎缩性断裂和骨质疏松症^[1] 。对于大面积骨缺损目前临床上常用的治疗措施主要是自体骨移植、异体骨移植(同种异体骨和异种异体骨)、无机生物材料、引导性骨再生及最近在国内外均较热门的骨组织工程技术^[2-7]。骨缺损的自行修复标准：用于研究的实验性骨缺损应大于实验动物自身自行愈合修复的范围，才能真实地反映修复材料或生长因子等对骨缺损的修复情况，这样的实验性骨缺损称为极限缺损，即在确定的研究时间内不可能自行愈合的最小缺损。一般认为同种异体骨移植是一种支架移植，用复合生长因子、成骨细胞、同种异体骨支架材料三者构建成为组织工程骨，将其植入缺损区，当宿主的毛细血管和纤维结缔组织长入同种异体骨支架的空隙内时，生长因子就开始促进成骨细胞诱导新骨生成。碱性成纤维细胞生长因子是一种能广泛促进来源于中胚层和神经外胚层细胞增殖的生物活性物质，可显著刺激髓源性骨髓间充质干细胞增殖，诱导向成骨细胞分化^{[ 8-11]}，碱性成纤维细胞生长因子在骨细胞发育及修复中具有重要作用。使细胞的增殖速度增加，细胞生长周期明显缩短，另外，碱性成纤维细胞生长因子还是一种强大的促血管生长因子，对血管的侵入及骨组织的成熟起到了促进作用。

因此，实验构建组织工程骨修复极限骨缺损的基本目的是：利用慢病毒载体将碱性成纤维细胞生长因子转染至羊骨髓间充质干细胞，加载同种异体骨支架材料^[12] ，植入大面积骨缺损区，同时观察4种材料修复羊髂骨极限骨缺损后4，8，12周的情况，观察碱性成纤维细胞生长因子转染对极限骨缺损修复是否有促进作用，并分析其作用机制。

材料方法

设计：对比观察实验。
时间及地点：细胞培养实验于2011年5月至12月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心细胞生物学实验室完成；碱性成纤维细胞生长因子慢病毒转染于2012年1月至12月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心细胞生物学实验室完成；动物实验于2011年7月至2012年12月在新疆医科大学第一附属医院实验动物中心完成。
材料：
同种异体骨支架材料：根据国际标准化组织和中国卫生部规定，对羊松质骨材料的生物安全性评价严格按照ISO10993《医疗器械生物学评价标准》的要求，采用急性毒性实验、热源实验、皮内刺激实验和细胞毒性实验初步评价物理、化学和物理联合化学组材料的生物相容性验证后制备[13]。

实验动物：选取新疆特色羊种阿勒泰大尾羊9只，12月龄，体质量(34.0±1.5) kg；4-6月龄阿勒泰大尾羊1只，雌雄不限。饲养在新疆医科大学动物中心(编号：IACUC-20110906004)，圈养，专人照管。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
实验方法：
骨髓抽取及细胞培养：4-6月龄小羊，髂骨区备皮，碘伏消毒皮肤，选16号骨穿针进行穿刺抽取约30 mL骨髓血以体积1∶5比例加入3%肝素钠内不间断颠倒混匀，迅速放入超净台，将骨髓血用无菌滤网过滤至50 mL离心管内，再以体积1∶1与DMEM-F12培养基(含1%青-链霉素，Hepas 2.38 g/L，L-谷氨酰胺0.6 g/L，抗坏血酸0.05-0.06 g/L,体积分数10%胎牛血清)共4-6 mL在 25 cm²细胞培养瓶内进行全骨髓培养法^[14-15] ，入37 ℃, 体积分数5%CO₂，恒温孵育箱内培养，每两三天进行半换液，直到血红细胞基本被培养基替代，镜下观察即可见细胞贴壁生长，此后每两三天全换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代或冻存，见图1。

成骨诱导：第1代骨髓间充质干细胞培养5-7 d后，将培养液换成诱导培养基(DMEM-F12培养基1%青-链霉素，Hepas 2.38 g/L，L-谷氨酰胺0.6 g/L，L-抗坏血酸0.05-0.06 g/L，β-甘油磷酸钠2.16 g/L，地塞米松 4 μg/L，体积分数10%胎牛血清)。入37 ℃, 体积分数5%CO₂，恒温孵育箱内培养，每两三天换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代至两三代冻存备用^[16] ，见图2。
构建碱性成纤维细胞生长因子慢病毒载体：复苏293-FT细胞，两三天传代，传代3次后，接种于6孔板，待细胞生长达90%-95%融合时即可开始转染碱性成纤维细胞生长因子基因质粒^[17] ，参照ViraPower™ Lentiviral Expression Systems说明书。转染293-FT细胞48 h后收集慢病毒上清1 mL/冻存管，-80 ℃冻存备用，见图3。

羊髂骨极限缺损模型建立：根据近年来动物实验骨缺损的研究方法^[18-20] ，将动物单独圈养隔离并禁食24 h，3%戊巴比妥钠0.005-0.02 mg/kg，耳缘静脉推注麻醉，将双侧髂骨区备皮，常规消毒后，由皮依次分层至骨膜，保留骨膜，避开髂骨骨皮质部分，在松质骨处，用牙科慢速机，裂钻制造15 mm(长)×10 mm(宽)×10 mm(高)大小骨缺损(预实验3个月已证明此范围缺损无法自行成骨修复)，用生理盐水冲洗去除骨碎屑后，分组植入骨支架材料、复合骨髓间充质干细胞支架骨材料^[21] 、β-磷酸三钙材料、碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞后支架骨材料，见图4。4组材料分别植入羊髂骨双侧4处缺损，9只羊在4，8，12周末每次随机处死3只。等待缺损区血充盈，再将骨膜复位缝合，依次缝合术区。

主要观察指标：术后第4，8，12周末拍摄X射线片观察术区骨愈合情况；分别在4，8，12周末每次处死3只羊，将植骨区扩大5 mm电钻锯断取出，去尽软组织，对标本进行大体、扫描电镜及苏木精-伊红染色观察。

讨论

用于研究的实验性骨缺损应大于实验动物自身自行愈合修复的范围，才能真实地反映修复材料或生长因子等对骨缺损的修复情况，这样的实验性骨缺损称为极限骨缺损，即在确定的研究时间内不可能自行愈合的最小缺损。有实验用犬随机分组，分别对其双侧下颌骨体部造成30 mm(长)×15 mm(宽)椭圆形缺损,用自身对照法进行对比研究,一侧骨缺损植入血管化复合组织工程骨，对侧为空白对照，结果空白组缺损区均未见新骨形成，说明30 mm(长)×15 mm(宽)的颌骨缺损无法自行修复愈合^[23] ，而实验侧将复合血管化组织工程骨植入缺损区，实验结果良好。

用于组织工程骨有3大要素：生长因子、种子细胞、支架材料。支架材料应具备以下条件^[24-27] ：①良好的生物相容性。有利于细胞的黏附、增殖、无毒、不致畸,不引起炎症反应。②适宜的生物降解性。支架材料的降解速率应与组织细胞的生长速率相适应，降解时间应能根据组织生长特性做有效调控。③有效的表面活性。有利于细胞黏附，并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境，能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞的表型表达。④一定的可塑性。便于加工成所需要的形状，并具有一定的机械强度，再植入体内一段时间内仍可保持其形状，从而使所形成的组织具有所需的外形。⑤具有三维多孔结构。支架材料具有多孔性和高孔隙率，孔隙率最好达90%以上，内表面积大,既有利于细胞的黏附和长入，又有利于营养成分代谢产物的排出。而作者所采用的同种异体骨支架材料，经过高温煅烧、脱脂、脱蛋白、脱细胞等理化方法，制备异种骨材料，尽量降低抗原性，从而有望获得安全可靠的异种骨移植材料^[28-30] 。

种子细胞骨髓间充质干细胞是以增殖为主的干细胞，因此如想达到其理想的成骨或成纤维化能力，必须加入相应的生长因子以利于骨髓间充质干细胞修复骨缺损的功能^[31-32] 。2009年李春明等^[33]利用碱性成纤维细胞生长因子基因转染犬骨髓间充质干细胞组织工程骨预构复合体+种植体修复犬颌骨极限骨缺损，制成 30 mm×20 mm×10 mm的全层骨缺损，通过实验研究发现，种植体复合碱性成纤维细胞生长因子基因转染的犬骨髓间充质干细胞(或未转染骨髓间充质干细胞)都能够良好地修复颌骨缺损,并能够使种植体与组织工程骨形成良好的骨结合。2011年Wang等^[34]将骨形态发生蛋白2/碱性成纤维细胞生长因子联合转染至骨髓间充质干细胞，并结合磷酸钙骨水泥植入beagle犬牙周种植体周围骨缺损区，术后12周的观察性实验结果显示，联合转染组有明显成骨优势。有实验将骨形态发生蛋白2基因修饰后的骨髓间充质干细胞复合天然珊瑚材料构建组织工程骨，将24只成年新西兰白兔制造双侧眼眶骨下缘 12 mm长的节段性骨缺损，随机分组对照实验后，得到结论，实验组骨形态发生蛋白2基因修饰的组织工程骨具有良好修复眶骨缺损的能力，对照组旷置组骨缺损在16周时也有少量的骨组织生成，但不能形成骨性连接，缺损部位被结缔组织充填，表明12 mm的兔眶骨缺损是不能自行愈合的^[35] 。陈涛等^[36]将12只实验用犬随机分组，分别对其双侧下颌骨体部造成30 mm(长)× 15 mm(宽)椭圆形缺损，用自身对照法进行对比研究，一侧骨缺损植入血管化复合组织工程骨, 对侧为空白对照，结果空白组缺损区均未见新骨形成，说明 30 mm(长)×15 mm(宽)的颌骨缺损无法自行修复愈合，而实验侧将复合血管化组织工程骨植入缺损区，实验结果良好。这些利用骨组织工程技术，特别是基因转染技术的复合组织工程骨，成为近几年修复大面积骨缺损的研究前沿。近年来，大量动物实验证实，组织工程骨能够修复多种部位的骨缺损，展示了其临床应用的美好前景。但组织工程骨植入体内后，距离毛细血管200 μm 以上的细胞将因为缺乏养分和氧气而不能存活。碱性成纤维细胞生长因子是一类具有广泛生物学活性的肽类物质，能显著促进血管形成和细胞有丝分裂。另外，碱性成纤维细胞生长因子还是一种强大的促血管生长因子, 对血管的爬入及骨组织的成熟起到了促进作用。被碱性成纤维细胞生长因子诱导后，骨髓基质干细胞可以分化为成纤维细胞样细胞，它还可以合成Ⅰ型胶原基质。Bonab等^[37]发现骨髓间充质干细胞在体外培养的过程中增殖和分化活性下降。有学者在加入碱性成纤维细胞生长因子后，骨髓间充质干细胞的增殖活性增强，骨髓间充质干细胞在S、G₂/M期的细胞增多。Kotev-Emeth等^[38]发现碱性成纤维细胞生长因子(3 μg/L)可明显促进骨髓间充质干细胞的增殖并能增加传代的次数。因此，本实验应用慢病毒载体技术将碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞，复合同种异体支架骨材料构建组织工程骨，修复羊髂骨大面积极限骨缺损，通过碱性成纤维细胞生长因子增强细胞成纤维化、血管化能力以促进成骨修复能力。

实验证明：①β-磷酸三钙材料证明，通过影像学、大体观察材料在第8周末开始出现了明显的强度降解和材料吸收，但单纯的材料无法在极限骨缺损的中央区成骨及成纤维血管化。②单纯支架材料在修复大面积骨缺损时，只有结合区有较好的成骨及纤维化生长，在第12周末，通过影像学、大体观察发现同种异体骨材料会出现密度及硬度的降解，这也符合骨修复的要求，不妨碍骨组织的重建和塑型，又能起到引导新骨形成，具有良好的生物相容性。③单纯细胞复合异种骨支架材料在修复大面积骨缺损时，也有一定的成骨及成软骨化作用，但术区中央仍无法满足成骨及纤维血管化。④碱性成纤维细胞生长因子转染后的骨髓间充质干细胞修复骨缺损增殖活力明显，从影像学、大体组织及苏木精-伊红染色切片观察证明在3个月期内，能够明显修复15 mm× 10 mm×10 mm缺损范围，术区中央均可见成骨样细胞出现，证明碱性成纤维细胞生长因子基因确有促纤维化、血管化作用，在大面积骨缺损修复时，有利于改善术区中央常常血管化不足的问题，本实验为临床上大面积骨缺损的修复提供了更可靠、更有效的治疗思路和方法。

复合骨髓间充质干细胞同种异体支架骨修复羊髂骨极限缺损

Bone marrow mesenchymal stem cells seeded into an allogeneic scaffold repair critical-sized iliac defects in sheep

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